超氧阴离子测试盒可见分光光度法
商品属性:
检测方法 |
规格 |
货号 |
可见分光光度法 |
50管/48样 |
GOY-SH163-B |
测定意义:
生物体内超氧阴离子等活性氧具有免疫和信号传导的作用,但积累过多时会对细胞膜及生物
大分子产生破坏作用,导致机体细胞和组织代谢异常。
测定原理:
超氧阴离子与盐酸羟胺反应生成 NO2-,NO2-在对氨基苯磺酸和 α-萘胺的作用下,生成红
色的偶氮化合物,在 530nm 处有特征吸收峰,根据 ΔA 值可以计算样品中 O2-含量,反应式为 NH2OH + 2O2- +H+ → NO2- + H2O2 + H2O。自备仪器和用品:天平、水浴锅、离心机、可见分光光度计、1 mL 玻璃比色皿、氯仿和蒸馏水。
试剂组成和配制:
提取液:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。
试剂一:液体 25mL×1 瓶,4℃保存。
试剂二:液体 20mL×1 瓶,4℃避光保存。
试剂三:液体 20mL×1 瓶,4℃避光保存。
试剂四:氯仿,自备。
酶液提取:
1. 植物、动物组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约
0.1g 组织,加入 1mL 提取液)进行冰浴匀浆,然后 10000g,4℃,离心 20min,取上清
置于冰上待测。。
2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建
议 500 万细胞加入 1mL 提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7
秒,总时间 3min);然后 10000g,4℃,离心 20min,取上清置于冰上待测。
3. 血清或培养液:直接测定。
测定操作:
空白管 测定管
样本(μL) 500
提取液(μL) 500
试剂一(μL) 400 400
混匀,37℃水浴 20min
试剂二(μL) 300 300
试剂三(μL) 300 300
混匀,37℃水浴 20min
试剂四(μL) 500 500
混匀,8000g,25℃,离心 5min,小心吸取上层水相 1mL, 1mL 玻璃比色皿,蒸馏水调零,
测定 A530。ΔA=A 测定-A 空白,空白管只要做一管。
计算公式:
标准曲线:y = 0.0242x - 0.0027,R2=0.9980
1. 组织:
(1)按照样本质量计算
超氧阴离子含量(nmol/g 鲜重)= (ΔA +0.0027)÷0.0242×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)×2
=148.76×(ΔA +0.0027)÷W
超氧阴离子产生速率(nmol/ g·min)=148.76×(ΔA+0.0027)÷W÷T
=7.44× (ΔA +0.0027)÷W
(2)按照蛋白质浓度计算
超氧阴离子含量(nmol/mg prot)= (ΔA+0.0027)÷0.0242×V 反总÷(V 样×Cpr)×2
=148.76×(ΔA+0.0027)÷Cpr
超氧阴离子产生速率(nmol/ mg prot·min)= 148.76×(ΔA+0.0027)÷Cpr÷T
=7.44× (ΔA+0.0027)÷Cpr
2. 细菌,真菌:
超氧阴离子含量(nmol/104 cell)= (ΔA+0.0027)÷0.0242×V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量)×2
= 148.76×(ΔA+0.0027)÷细胞数量
超氧阴离子产生速率(nmol/104 cell·min)= 148.76×(ΔA+0.0027)÷细胞数量÷T
=7.44× (ΔA+0.0027)÷细胞数量
3. 血清或培养液
超氧阴离子 含量(nmol/mL)= (ΔA+0.0027)÷0.0242×V 反总÷V 样×2
=148.76× (ΔA+0.0027)
超氧阴离子产生速率(nmol/mL·min)= 148.76× (ΔA+0.0027) ÷T
= 7.44× (ΔA+0.0027)
V 样总:加入提取液体积,1 mL; V 反总:反应总体积,0.9mL;V 样:反应中样品体积,
0.5mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样品质量,g;T:反应时间,20min;2: 2
分子 O2
-参与反应生成 1 分子 NO2
-。
注意事项
1、 吸光值大于 2,样品适当稀释再测定,注意计算公式里乘以稀释倍数。
2、 样品制备好之后,立刻进行测定,请勿将样品进行长时间的低温保存,以免影响测定结
果。
3、 试剂四有一定的毒性,请操作时做好防护措施。
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