α淀粉酶测试盒微量法

商品属性：

测定意义：

淀粉水解酶，包括 α-淀粉酶和 β-淀粉酶。α-AL (EC 3.2.1.1)随机催化淀粉中 α-1,4-糖苷键水 解，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为 液化酶。

测定原理：

淀粉水解酶催化淀粉水解生成还原糖，还原糖还原 3,5-二硝基水杨酸生成棕红色物质，在 540 nm 有吸收峰；通过测定 540 nm 吸光度增加速率，计算淀粉酶活性。α-AL 耐热，但是 β淀粉酶可在 70℃钝化 15min。因此粗酶液经过 70℃钝化 15min，就只有 α-AL 能够催化淀粉 水解。 需自备的仪器和用品： 可见分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔 板、研钵和蒸馏水。  

试剂组成和配制：

试剂一：液体 15mL×1 瓶，室温保存。若有黄色晶体析出，可 90℃加热溶解后再用。 试剂二：液体 7.5mL×1 瓶，4℃保存。若有沉淀析出，可 70℃加热溶解后使用。

酶液提取：
组织：称取 0.1~0.2g 样本（建议称取约 0.1g 样本），加 1 mL 蒸馏水匀浆；将匀浆倒入离心 管中，在室温下放置提取 15min，每隔 5min 振荡 1 次，使其充分提取；3000g，25℃离心 10min，吸取上清液并且加蒸馏水定容至 10 mL，摇匀，即为淀粉酶原液。 血清（浆）：直接检测。  
测定操作：
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长到 540 nm，蒸馏水调零。 2、 试剂一和试剂二 40℃预热 10min。 3、测定步骤： 试剂（μL） 对照管 测定管 α-淀粉酶原液 75 75 70℃水浴 15min 左右，流水冷却。 蒸馏水 75 试剂二 75 在 40℃恒温水浴中准确保温 5min 试剂一 150 150 混匀，95 度水浴 5min，冷却，取 200μL 至微量石英比色皿或 96 孔板中，540nm 处读 取吸光值，计算 ΔA=A 测定管-A 对照管。每个测定管需设一个对照管。 
计算公式：
α-淀粉酶活性计算： a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下 1、标准条件下测定回归曲线为 y=3.7215x -0.1778； x 为标准品浓度（mg/mL），y 为吸光值。 2、α-淀粉酶活性 （1）按照样本质量计算 单位定义：每 g 组织每分钟催化产生 1mg 还原糖定义为 1 个酶活力单位。 α- 淀 粉 酶 活 性 (mg/min/g 鲜 重 )=[(ΔA ＋ 0.1778)÷3.7215×V 反 总 ]÷(W×V 样 ÷V 样 总)÷T=1.075×(ΔA＋0.1778)÷W （2）按照蛋白质含量计算 单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1mg 还原糖定义为 1 个酶活性单位。 α-淀粉酶活性(mg/min/mg prot)= [(ΔA＋0.1778)÷3.7215×V 反总]÷（V 样×Cpr）÷T=0.1075× (ΔA＋0.1778) ÷Cpr （3）血清（浆）样本中 α-淀粉酶活性计算 单位定义：每 mL 血清（浆）每分钟催化产生 1mg 还原糖定义为 1 个酶活性单位。 α-淀粉酶活性(mg/min/mL)= [(ΔA＋0.1778)÷3.7215×V 反总]÷V 样÷T=0.1075×(ΔA＋0.1778) 反总：反应体系总体积，0.15mL；V 样：加入反应体系中样本体积，0.075 mL；V 样总：提 取液总体积，10 mL； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间， 5min。 b.用 96 孔板测定的计算公式如下 1、标准条件下测定回归曲线为 y=2.481x -0.1778； x 为标准品浓度（mg/mL），y 为吸光值。 2、α-淀粉酶活性 （1）按照样本质量计算 单位定义：每 g 组织每分钟催化产生 1mg 还原糖定义为 1 个酶活力单位。 α- 淀 粉 酶 活 性 (mg/min/g 鲜 重 )=[(ΔA ＋ 0.1778)÷2.481×V 反 总 ]÷(W×V 样 ÷V 样 总)÷T=1.612×(ΔA＋0.1778)÷W （2）按照蛋白质含量计算 单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1mg 还原糖定义为 1 个酶活性单位。 α-淀粉酶活性（mg/min/mg prot）=[(ΔA＋0.1778)÷2.481×V 反总]÷（V 样×Cpr）÷T =0.1612 ×(ΔA＋0.1778) ÷Cpr （3）血清（浆）样本中 α-淀粉酶活性计算 单位定义：每 mL 血清（浆）每分钟催化产生 1mg 还原糖定义为 1 个酶活性单位。 α-淀粉酶活性(mg/min/mL)= [(ΔA＋0.1778)÷2.481×V 反总]÷V 样÷T=0.1612×(ΔA＋0.1778) V 反总：反应体系总体积，0.15mL；V 样：加入反应体系中样本体积，0.075 mL；V 样总： 提取液总体积，10 mL； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间， 5min。 
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