超氧阴离子测试盒微量法

商品属性：

测定意义：

生物体内超氧阴离子等活性氧具有免疫和信号传导的作用，但积累过多时会对细胞膜及生物

大分子产生破坏作用，导致机体细胞和组织代谢异常。
测定原理：

超氧阴离子与盐酸羟胺反应生成 NO2－，NO2－在对氨基苯磺酸和 α－萘胺的作用下，生成红色的偶氮化合物，在 530nm 处有特征吸收峰，根据 ΔA 值可以计算样品中 O2－含量，反应式为 NH2OH + 2O2－ ＋H＋ → NO2－ ＋ H2O2 ＋ H2O。自备仪器和用品:天平、水浴锅、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、氯仿和蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体 110mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 20mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体 15mL×1 瓶，4℃避光保存。

试剂三：液体 15mL×1 瓶，4℃避光保存。

试剂四：氯仿，自备。
酶液提取：
1. 植物、动物组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约
0.1g 组织，加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后，10000g，4℃，离心 20min，取上
清置于冰上待测。
2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建
议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7
秒，总时间 3min）；然后 10000g，4℃，离心 20min，取上清置于冰上待测。
3. 血清或培养液：直接测定。

测定操作：
1、 分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长至 530nm。

2、操作表

空白管 测定管

样本（μL） 200

提取液（μL） 200

试剂一(μL) 160 160

混匀，37℃水浴 20min

试剂二（μL） 120 120

试剂三（μL） 120 120

混匀，37℃水浴 20min

试剂四（μL） 200 200

混匀，8000g，25℃，离心 5min，小心吸取上层水相 200μL 于微量石英比色皿/96 孔板中，

测定 A530。ΔA=A 测定-A 空白，空白管只要做一管。
计算公式：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线：y = 0.0242x - 0.0027，R2=0.9980
1. 组织：
（1）按照样本质量计算
超氧阴离子含量（nmol/g 鲜重）= (ΔA+0.0027)÷0.0242×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)×2
=148.76×(ΔA+0.0027)÷W
超氧阴离子产生速率（nmol/ g·min）=148.76×(ΔA+0.0027)÷W÷T
=7.44× (ΔA+0.0027)÷W
（2）按照蛋白质浓度计算
超氧阴离子含量（nmol/mg prot）= (ΔA+0.0027)÷0.0242×V 反总÷(V 样×Cpr)×2
=148.76×(ΔA+0.0027)÷Cpr
超氧阴离子产生速率（nmol/ mg prot·min）= 148.76×(ΔA+0.0027)÷Cpr÷T
=7.44× (ΔA+0.0027)÷Cpr
2. 细菌，真菌：
超氧阴离子含量（nmol/104 cell）= (ΔA+0.0027)÷0.0242×V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量)×2
= 148.76×(ΔA+0.0027)÷细胞数量
超氧阴离子产生速率（nmol/104 cell·min）= 148.76×(ΔA+0.0027)÷细胞数量÷T
=7.44× (ΔA+0.0027)÷细胞数量
3. 血清或培养液
超氧阴离子 含量（nmol/mL）= (ΔA+0.0027)÷0.0242×V 反总÷V 样×2
=148.76× (ΔA+0.0027)
超氧阴离子产生速率（nmol/mL·min）= 148.76× (ΔA+0.0027) ÷T
= 7.44× (ΔA+0.0027)
V 样总：加入提取液体积，1 mL； V 反总：反应总体积，0.36mL；V 样：反应中样品体积，
0.2mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g；T：反应时间，20min；2: 2 分
子 O2
－参与反应生成 1 分子 NO2
－。
b.用 96 孔板测定的计算公式如下
标准曲线：y = 0.0121x - 0.0027，R2 = 0.9980
1. 组织：
（1）按照样本质量计算
超氧阴离子含量（nmol/g 鲜重）= (ΔA+0.0027)÷0.0121×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)×2
=297.52× (ΔA+0.0027)÷W
超氧阴离子产生速率（nmol/ g·min）=297.52× (ΔA+0.0027)÷W÷T
=14.88× (ΔA+0.0027)÷W
（2）按照蛋白质浓度计算
超氧阴离子含量（nmol/mg prot）= (ΔA+0.0027)÷0.0121×V 反总÷(V 样×Cpr)×2
=297.52× (ΔA+0.0027)÷Cpr
超氧阴离子产生速率（nmol/ mg prot·min）= 297.52× (ΔA+0.0027)÷Cpr÷T
=14.88× (ΔA+0.0027)÷Cpr
2. 细菌，真菌：
超氧阴离子含量（nmol/104 cell）=(ΔA+0.0027)÷0.0121×V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量)×2
=297.52× (ΔA+0.0027)÷细胞数量
超氧阴离子产生速率（nmol/104 cell·min）=297.52× (ΔA+0.0027)÷细胞数量÷T
3. 血清或培养液
超氧阴离子 含量（nmol/mL）=(ΔA+0.0027)÷0.0121 ×V 反总÷V 样×2
=297.52×(ΔA+0.0027)
超氧阴离子产生速率（nmol/mL·min）= 297.52×(ΔA+0.0027) ÷T
=14.88×(ΔA+0.0027)
V 样总：加入提取液体积，1 mL； V 反总：反应总体积，0.36mL；V 样：反应中样品体积，
0.2mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g；T：反应时间，20min；2：2
分子 O2
－参与反应生成 1 分子 NO2
－。
注意事项
1、 OD 值大于 1，样品适当稀释再测定，注意计算公式里乘以稀释倍数。
2、 样品制备好后，立刻进行测定，请勿将样品进行长时间的低温保存，以免影响测定结果。
3、 试剂四有一定的毒性，请操作时做好防护措施。

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