NADPH细胞色素C还原酶(NCR)测试盒微量法

商品属性：

测定意义：

?胞色素 P450 酶是一组?要存在于肝脏的同工酶，在外源物质代谢中?有重要作用，尤? 是药物和毒物的代谢?NCR 作? P450 酶系的重要一员，催化氧化型 P450 还原再生.

测定原理：

NCR 催化 NADPH 还原氧化型?胞色素 C，还原型?胞色素 C 在 550nm 处有特征吸收峰? 通过测定 550nm 吸光度的增加速率，来?算 NCR 活性? 自备仪器和用品： 普通离心机，超速离心机?可调式移液枪?紫外分光光度?/酶标仪?微?石英比色皿/96 孔 板和蒸馏水 

试剂组成和配制：

试剂一?粉剂×2 瓶，4℃保存?临用前?据用??瓶加 100mL 蒸馏水充分溶解? 试剂??液体×1 瓶，4℃保存? 试剂й?粉剂×1 管，-20℃保存?临用前配制，加 1.04 mL 蒸馏水充分溶解，4℃保存? 试剂四?粉剂×1 管，4℃保存?临用前配制，加 1100 μL 蒸馏水充分溶解，4℃保存? 

酶液提取：
1?除去?胞?和线粒体等??约 0.5g 组?，加入 4℃预冷的 1 mL 试剂一，冰к充分研磨， 10 000g 4℃离心 30min，取к清液，转移到超速离心管中? 2?粗制微粒体?4℃，100 000g，离心 60min，?к清液? 3?除血红蛋白等杂质?向步骤 2 的沉淀中加 1 mL 试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100 000g 离心 30min，?к清液? 4?最?微粒体?向步骤 3 的沉淀中加试剂? 0.5 mL，盖紧后充分震荡溶解，4℃保存?测?  
测定操作：
1. 分光光度?/酶标仪预热 30 min，调节波长到 550 nm，蒸馏水调零? 2. 试剂?在 37℃水浴中预热 30min? 3. 空白管?取微?石英比色皿/96 孔板，依次加入 10μL 蒸馏水?180μL 试剂??10μL 试剂 й和 10μL 试剂四，迅速混匀后于 550nm 处测定 2min 内吸光值变化，第 10s 和第 130s 吸光 值?△A 空白管=A2-A1? 4. 测定管?取微?石英比色皿/96 孔板，依次加入 10μL 提取液?180μL 试剂??10μL 试剂 й和 10μL 试剂四，迅速混匀后于 550nm 处测定 2min 内吸光值变化，第 10s 和第 130s 吸光 值?△A 测定管=A4-A3? 注意?空白管只需做一次? 
计算公式：
a.使用微?石英比色皿测定的?算公式如л ?1?按蛋白浓度?算 活性单位定义?37℃中，?毫克蛋白?分钟催化产生 1μmol 还原型?胞色素 C ? 1 个酶活 单位? NCR ((nmol/min /mg prot)= ( A △ 测定管-△A 空白管)÷(ε×d)×V 反总÷?Cpr×V ??÷T = 550×( A △ 测定管-△A 空白管)÷Cpr ?2?按?本质??算 活性单位定义?37℃中，?克组??分钟催化产生 1μmol 还原型?胞色素 C ? 1 个酶活单 位? NCR ((nmol/min/g 鲜重)= ( A △ 测定管-△A 空白管)÷(ε×d)×V 反总÷(V ?÷V ?总×W)÷T =275×( A △ 测定管-△A 空白管)÷W ε?还原型?胞色素 C 摩尔消光系数，19100L/mol/cm=0.0191L/μmol/cm?d?比色皿光??cm?， 1cm?V 反总?反应体系总体??L?，210μL=2.1×10-4L?Cpr?к清液蛋白质浓度?mg/mL?， 需要另外测定?V ??加入反应体系中к清液体??mL?，10μL=0.01mL?V ?总?提取液 体?，0.5 mL?T?反应时间?min?，2min ? b.使用 96 孔板测定的?算公式如л ?1?按蛋白浓度?算 活性单位定义?37℃中，?毫克蛋白?分钟催化产生 1μmol 还原型?胞色素 C ? 1 个酶活 单位? NCR ((nmol/min/mg prot)= ( A △ 测定管-△A 空白管)÷(ε×d)×V 反总÷?Cpr×V ??÷T = 1100×( A △ 测定管-△A 空白管)÷Cpr ?2?按?本质??算 活性单位定义?37℃中，?克组??分钟催化产生 1μmol 还原型?胞色素 c ? 1 个酶活单位? NCR ((nmol/min/g 鲜重) = ( A △ 测定管-△A 空白管)÷(ε×d)×V 反总÷(V ?÷V ?总×W)÷T = 550×( A △ 测定管-△A 空白管)÷W ε?还原型?胞色素 C 摩尔消光系数，19100L/mol/cm=0.0191L/μmol/cm?d?96 孔板光??cm?， 0.5cm?V 反总?反应体系总体??L?，210μL=2.1×10-4L?Cpr?к清液蛋白质浓度?mg/mL?， 需要另外测定?V ??加入反应体系中к清液体??mL?，10μL=0.01mL?V ?总?提取液 体?，0.5mL?T?反应时间?min?，2min ? 注意?项? 试剂й?试剂四临用前配制，配好未使用完的 4℃可保存两天
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