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HAT培养基筛选杂交瘤细胞的标准操作流程
2026-03-30
HAT培养基筛选杂交瘤细胞的详细步骤，核心在于利用DNA合成双途径机制实现选择性筛选，其中最关键的环节是细胞融合后24小时加入HAT培养基，并维持10–14天以完成有效筛选。
细胞融合准备
免疫小鼠后取脾脏分离B淋巴细胞，与HGPRT缺陷型骨髓瘤细胞按10:1比例混合。
使用?聚乙二醇（PEG）或电融合法?诱导细胞融合，融合时间控制在90秒左右，避免细胞毒性 。
加入HAT培养基
融合结束后 24小时 开始添加HAT培养基，防止氨基蝶呤对刚融合细胞造成过度损伤 。
将细胞悬液接种至含饲养层细胞（如小鼠腹腔巨噬细胞）的96孔板中，每孔加入100–200 μL HAT培养基 。
选择性培养与换液
第1–7天：每日观察细胞状态，注意是否有克隆形成。
第5天左右：进行半量换液，移除一半旧培养基，补充等量新鲜HAT培养基，以维持营养和核酸前体浓度 。
第10–14天：持续培养至未融合细胞完全死亡，仅剩杂交瘤细胞形成可见克隆 。
过渡到HT培养基
筛选成功后，逐步用HT培养基?替代HAT培养基（去除氨基蝶呤），减少长期毒性影响。
最终转为完全培养基（如DMEM + 10% FBS）进行扩增 。
克隆化与鉴定
采用有限稀释法将阳性孔细胞稀释至0.5–1个/孔，确保单克隆来源。
结合ELISA检测抗体分泌情况，筛选出稳定高表达的单克隆株 。
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