苹果酸合酶(MS)测试盒可见分光光度法

商品属性：

测定意义：

苹果酸合酶（MS，EC 4.1.3.2）是属于转移酶中酰基转移酶的一类，主要存在于植物和微生 物中。MS 是乙醛酸循环的关键酶之一，在 MS 催化下乙醛酸与乙酰辅酶 A 反应生成苹果酸。
测定原理：

MS 催化乙酰 CoA 和乙醛酸产生苹果酸，同时生成辅酶 A，辅酶 A 使无色的 DTNB 转变成 黄色的 TNB，在 412nm 处有特征吸光值。 需自备的仪器和用品： 分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰、和蒸馏 水
试剂组成和配制：

试剂一：液体 100 mL×1 瓶，4℃保存； 试剂二：液体 25 mL×1 瓶，4℃保存； 试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 25mL 试剂一充分溶解后使用，用不完的试剂 分装后-20℃保存，禁止反复冻融； 试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入 6 mL 试剂一充分溶解后使用，用不完的试剂分 装后-20℃保存，禁止反复冻融；
样本的前处理：
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量 （104 个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 试剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 2、组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 试剂一），进行冰浴匀浆，8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
测定操作：
1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 412nm，蒸馏水调零。 2、样本测定 在 1mL 玻璃比色皿中依次加入 100μL 样本、400μL 试剂二，400μL 试剂三和 100μL 试 剂四，混匀，立即记录 412 nm 处反应 5min 时的吸光值 A1 和 10min 时的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1。
计算公式：
（1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。 MS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷(V 样×Cpr) ÷T=147×ΔA÷Cpr 此法需要自行测定样本蛋白质浓度。 （2）按样本鲜重计算： 单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。 MS（nmol/min /g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷（W ×V 样÷V 样总）÷T=147×ΔA÷W （3）按细菌或细胞密度计算：单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。 MS（nmol/min /104 cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷（500×V 样÷V 样总）÷T=0.294×ΔA V 反总：反应体系总体积，1×10-3 L；ε：TNB 摩尔消光系数，1.36×104 L / mol /cm；d：比 色光径，1 cm；V 样：加入样本体积，0.1 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应 时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数， 500 万。
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