去除交叉反应性抗体实验步骤方法
2024-11-19
去除交叉反应性抗体实验步骤方法:
1. 将适当菌株（如 Y1090 hsdR、XLl-Blue 或 DH1) 的 1L 培养物培养至静止期。
2. 用 Sorvall GSA 转头（5000r/min) 于 4°C 以 4000 g 离心 20 min 收获菌体。
3. 弃去培养基，倒置离心管排出残留培养液。
4. 将沉淀物重悬于 100 ml 的细胞裂解缓冲液中。
5. 加入 200 mg *，于室温温育菌液 20 min。
6. 加入 1 mg 胰 DNA 酶, 和 200ul Triton X-100。
7. 于 4°C 温育菌液 1 h, 或温育至上清由混浊变清亮且黏度降低。
8. 将细菌裂解液于 4°C 以 8000 g(8200r/min 用 SorvallSS-34 转头）离心 20 min, 小心将上清液倒入另一个烧杯内。
9. 用 1mol/LNaOH 将上清液 pH 调至 9.0。
10. 用 Lowry,Bradford 或其他方法检测裂解液中蛋白的浓度。
11. 将提取液骤冷至 0°C, 并按操作说明将菌体蛋白质结合于溴化氢活化的Sepharose 4B 或 Affi-Gel 10。
12. 使用前，用含 0.2%(m/V) *的 TBS 平衡与大肠杆菌提取物结合的 Sepharose 4B 或 Affi-Gel 10 树脂。
13. 每通过亲和层析纯化 1 mgIgG, 需要 1 ml 固定体积的与大肠杆菌抗原相偶联的树脂。IgG 和偶联的树脂混匀后，在转鼓中于室溫溫育 12~18 h。
14. 将匀浆液装到亲和层析柱上。用 TBS 洗脱抗体。收集洗脱液（每管 0.2 柱床体积）至OD280 降为 0。合并各管抗体，并将亲和纯化抗体贮存于-20°C, 以备免疫筛选时用。
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